Il Museo Civico occupa il primo piano del Palazzo pubblico di Siena, uno dei più noti e significativi edifici gotici dell'Italia medievale, eretto per volere del Governo dei Nove (1287-1355). I lavori per l'edificazione del palazzo, verosimilmente condotti a partire dal 1297 riutilizzando in parte murature preesistenti, interessarono in un primo tempo il corpo centrale già ultimato nel 1304 con la realizzazione della sala detta del Mappamondo, sede delle riunioni del Consiglio generale della Repubblica fino al 1343. Tra il 1307 e il 1311 un primo ampliamento avrebbe interessato l'area alla destra in direzione di Malborghetto con l'edificazione della cosiddetta ala dei Nove.

Secondo quanto attestato da antiche cronache verso il 1325 avrebbe invece avuto inizio l'ampliamento alla sinistra del corpo centrale verso Salicotto con la costruzione dell'ala del Podestà conclusa successivamente al 1330. L'edificazione del palazzo si sarebbe conclusa nel 1348 con la realizzazione della rocca in travertino della Torre del Mangia, eretta a partire dal 1325 nell'angolo della via detta di Malcucinato e con la sistemazione della grande loggia sul retro nel 1350. Sorto con la precipua funzione di ospitare sia la politica che le maggiori funzioni amministrative dell'antico Stato senese, solo con l'Unità d'Italia il palazzo divenne visitabile in giorni deputati e, a seguito del grande successo ottenuto dalla Mostra dell'Antica Arte Senese, allestita al suo interno nel 1904, stabilmente aperto a partire dal 1907 relativamente ad alcune sale del piano nobile. La sua istituzione ufficiale può invece essere fatta risalire al 1909, data di approvazione di un apposito regolamento. Negli anni il Museo, dovendo convivere con le funzioni istituzionale e amministrative ancora ospitate all'interno del Palazzo, ha visto un'estrema variabilità sia relativamente all'estensione dei propri spazi, che alle collezioni esposte (topografiche, numismatiche, pittoriche). I più recenti progetti allestitivi e museografici risalgono rispettivamente al 1985 e al 1992.

La decorazione del palazzo, che ne segue di pari passo le varie vicende costruttive, costituisce ancora oggi la sua principale caratteristica. Le sale del piano nobile, che rappresentano il fulcro del Museo Civico, presentano in particolare una densa concentrazione di affreschi e dipinti murali spettanti ai più importanti interpreti della scuola pittorica senese dal Trecento all'Ottocento. Capolavori come la Maestà (1315-1321) o il Guidoriccio da Fogliano all'assedio di Montemassi (1330) di Simone Martini, la Presa del castello di Giuncarico (1314 ca.) attribuita a Duccio di Buonsigna, le Allegorie e gli Effetti del buono e del cattivo governo (1338-1339), il ciclo pittorico con le Virtù pubbliche ed episodi degli eroi greci e romani (1529-1535), realizzato da Domenico Beccafumi sul soffitto della sala del Concistoro, sono unanimemente riconosciutì come vertci dell'arte non solo senese ma mondiale. Al di là dell'imponente apparato decorativo che lo rende un contesto di ineguagliabile bellezza, il museo conserva anche alcuni importanti nuclei collezionistici stratificatisi nel tempo e oggi solo in parte esposti, che ne attestano la complessa e articolata vicenda costitutiva, tra cui oltre alle opere direttamente commissionate per il Palazzo, spiccano le oreficerie, le pregevoli raccolte numismatiche e una importante selezione di sculture, dipinti su tavola e tela di scuola senese e non.